Eusébio là người giữ kỉ lục ghi bàn cho đội tuyển Bồ Đào Nha với 41 bàn trong 64 trận, cho đến khi Pauleta vượt qua kỉ lục này trong trận gặp Latvia ngày 12 tháng 10 năm 2005. Ông có trận đầu tiên khoác áo đội tuyển trong trận gặp Luxembourg ngày 19 tháng 10 năm 1961, tuy nhiên trận đấu này Bồ Đào Nha thua 2 – 4.

Eusébio là Vua phá lưới World Cup 1966 với 9 bàn thắng, trong đó có 4 bàn ở trận tứ kết gặp Bắc Triều Tiên, trận đấu mà Bồ Đào Nha đã lội dòng nước ngược khi thắng chung cuộc 5 – 3 sau khi bị dẫn 0-3.

Trận bán kết gặp Anh, Eusébio ghi bàn thắng duy nhất cho đội nhà trên chấm phạt đền ở phút 82. Các cổ động viên Bồ Đào Nha còn nhớ đến trận đấu đó với số bàn thắng bị từ chối cao bất thường, riêng Eusébio không được công nhận 4 bàn do việt vị.

Cùng với danh hiệu Vua phá lưới World Cup 1966, Eusébio còn lập các kỉ lục trong năm đó: ghi nhiều bàn thắng trên chấm phạt đền nhất (không kể sút luân lưu) (4 bàn), 4 bàn vào lưới Bắc Triều Tiên ở tứ kết giúp Bồ Đào Nha cân bằng kỉ lục giành thắng lợi chung cuộc khi bị dẫn khoảng cách lớn nhất (3 bàn, bằng với Áo năm 1954). Người Anh ấn tượng với màn trình diễn của Eusébio đến nỗi đã ngay lập tức dựng tượng sáp của ông trong bảo tàng Madame Tussauds.

Tuy nhiên sau đó Eusébio không còn tham dự một vòng chung kết World Cup nào nữa, mặc dù có tham dự vòng loại World Cup 1970 và 1974. Trận đấu cuối của ông cho đội tuyển quốc gia là trận hoà Bulgaria 2-2 ở vòng loại World Cup ngày 19 tháng 10 năm 1973, đúng 12 năm sau trận đấu ra mắt.

Vào lúc 3h30 ngày 5/1/2014 (giờ địa phương), huyền thoại bóng đá Eusébio đã qua đời ở tuổi 71, nguyên nhân dẫn tới cái chết đột ngột của Eusébio liên quan tới một căn bệnh về tim.